Celična kultura je eno najpomembnejših orodij, ki se uporablja v celični in molekularni biologiji, saj zagotavlja odličen modelni sistem za preučevanje normalne fiziologije in biokemije (npr. presnovne študije, staranje), učinkov zdravil in strupenih spojin na celice ter učinkov celične mutageneze in karcinogeneze. Uporablja se tudi pri presejanju in razvoju zdravil ter v obsežni proizvodnji bioloških spojin (npr. cepiv, terapevtskih proteinov). Glavna prednost uporabe celične kulture za katero koli od teh aplikacij je doslednost in ponovljivost rezultatov, ki jih je mogoče dobiti z uporabo serije klonskih celic.
celične kulture
Kultura celic se nanaša na odvzem celic iz živali ali rastlin in njihovo rast v ugodnem umetnem okolju. Celice je mogoče odstraniti neposredno iz tkiva in pred gojenjem encimsko ali mehansko disociirati ali pa jih pridobiti iz uveljavljenih celičnih linij ali sevov.
1. Primarno usposabljanje
Primarna kultura se nanaša na stopnjo kulture po tem, ko so bile celice izolirane iz tkiva in razmnožene pod ustreznimi pogoji, dokler ne zasedejo vsega razpoložljivega substrata (tj. dosežejo sotočje). Na tej stopnji je treba celice subkultivirati (tj. pasirati), tako da jih prenesemo v novo posodo s svežim rastnim medijem, da zagotovimo več prostora za nadaljnjo rast.
2. Celične linije
Po prvi subkulturi se primarne kulture imenujejo celične linije ali subkloni. Celične linije, pridobljene iz primarnih kultur, imajo končno življenjsko dobo (tj. so končne) in pri njihovem pasiranju prevladujejo celice z največjim rastnim potencialom, kar ima za posledico določeno stopnjo genotipske in fenotipske enotnosti v spolu populacije.
3. Celične linije
Celična linija postane celični sev, če je subpopulacija celične linije aktivno izbrana iz kulture s kloniranjem ali drugimi metodami. Celične linije pogosto pridobijo dodatne genetske spremembe po začetku starševske linije.
4. Omejene celične linije in neprekinjene celične linije
Normalne celice se običajno delijo le omejeno število krat, preden izgubijo sposobnost razmnoževanja, kar je gensko določen dogodek, imenovan staranje; te celične linije imenujemo končne. Vendar pa nekatere celične linije postanejo nesmrtne s procesom, imenovanim transformacija, ki se lahko pojavi spontano ali pa je induciran kemično ali virusno. Končna celična linija postane neprekinjena celična linija, ko je podvržena transformaciji in pridobi sposobnost delitve za nedoločen čas.
Neprekinjeno gojene celične linije so nagnjene k genetskemu odnašanju, končne celične linije so obsojene na staranje, vse celične kulture so dovzetne za mikrobno kontaminacijo, okvara opreme pa se lahko pojavi tudi v najbolje vodenih laboratorijih. Ker so uveljavljene celične linije dragocen vir, katerega zamenjava je draga in dolgotrajna, jih je nujno kriokonzervirati za dolgoročno shranjevanje.
Ko se iz subkulture pridobi majhno število preostalih celic, jih je treba zamrzniti kot semensko zalogo in zaščititi pred splošno laboratorijsko uporabo. Delovne zaloge lahko pripravimo in dopolnimo iz zamrznjenih semenskih zalog. Če je zaloga semena izčrpana, lahko kriokonzervirano delovno zalogo uporabimo kot vir za pripravo sveže zaloge semena, s čimer dosežemo minimalno povečanje količine od začetne zamrznitve.
Najboljši način za kriokonzervacijo gojenih celic je v tekočem dušiku, v popolnem mediju, v prisotnosti krioprotektorjev, kot sta dimetil sulfoksid (DMSO) ali glicerol. Krioprotektorji znižajo zmrziščno točko medija in zmanjšajo tudi hitrost ohlajanja, kar močno zmanjša tveganje za nastanek ledenih kristalov, ki lahko poškodujejo celice in povzročijo celično smrt.
Znano je, da DMSO olajša vstop organskih molekul v tkiva. Pri ravnanju z reagenti, ki vsebujejo dimetil sulfoksid, je treba uporabljati opremo in postopke, primerne za nevarnosti tega materiala. Reagente zavrzite v skladu z lokalnimi predpisi.
Gojite celice iz zamrznjenih delovnih zalog celic
Ne pozabite izpolniti dnevnika mobilne banke
Določite število prehodov, npr. če bi prejšnje celice zamrznili in jih odmrznili trikrat, bi bil postopek odmrzovanja četrti prehod.
Dodajte rastni medij (minimalno gojišče, telečji serum in antibiotike) v bučke T75, označene s celično linijo, številko prehoda in datumom
Bučko postavite vodoravno v CO inkubator pri 37 stopinjah in 5 odstotkih CO za vsaj 15 minut. To bo segrelo medij in doseglo normalen pH (7.0-7.6).
Zamrznjene viale s celičnimi linijami odtajajte v vodni kopeli pri 37 stopinjah z nežnim mešanjem. Da zmanjšate tveganje kontaminacije, držite tesnilni obroč in pokrov nad gladino vode (2-5 minut).
Postavite vialo v biološko varnostno omarico (BSL-2). Da preprečite kontaminacijo, obrišite s 70-odstotnim etanolom, preden odprete vialo.
Vsebino zamrznjene celične bučke prenesite v bučko T75, ki vsebuje rastni medij. Mešajte in nežno pretresite bučko, da se celice enakomerno porazdelijo po površini bučke.
Bučko inkubirajte čez noč v CO2 inkubatorju pri 37 stopinjah s 5 odstotki CO2. Pustite, da se celice pritrdijo čez noč
spreminjanje medija rasti
Inkubirajte bučko dodatnih 2-4 dni pri 37 stopinjah, 5 odstotkih CO2 in spremljajte, dokler celice ne zrastejo
Ko celice dosežejo približno 90-odstotno konfluentnost, lahko zalogo celic povečate z bučko T150.
