Ko ste ravnokar diplomirali in vstopili v službo, se soočite s kupom samostalnikov, ki se soočajo s kvantitativnimi PCR poskusi v realnem času. Ste v zadregi, kje začeti? Kaj pomenijo krivulja ojačanja, standardna krivulja, prag, vrednost CT, krivulja taljenja in osnovna linija? Fluorescentne slike iz teh poskusov so presvetle, vendar se zdi, da jih ne morem prepoznati. Danes vas bomo spoznali s tem znanjem in koncepti v dveh delih: tehnični izrazi in pogosta vprašanja.
I. del Strokovni pogoji
1. Krivulja ojačanja
Krivulja pomnoževanja se nanaša na krivuljo, kjer je številka cikla na abscisi, intenzivnost fluorescence v realnem času med reakcijo pa na ordinati med PCR.
2. Izhodišče
Izhodiščna vrednost se nanaša na majhno spremembo fluorescenčnega signala v prvih nekaj ciklih reakcije pomnoževanja PCR. Raven signala je blizu ravne črte, ki je osnovna črta.
3. Nastavitev praga fluorescence
Običajno se fluorescenčni signal prvih 15 ciklov reakcije PCR uporablja kot signal ozadja fluorescence, prag fluorescence pa je 10-kratni standardni odklon fluorescenčnega signala med 3-15 cikli PCR in prag fluorescence se nastavi med eksponentno fazo pomnoževanja PCR. Običajno ima vsak instrument pred uporabo svoj prag fluorescence.
4. CT vrednost
Vrednost CT predstavlja število ciklov, ki se bodo zgodili za vsako reakcijsko epruveto PCR, ko fluorescentni signal doseže nastavljeni prag. Iz raziskav vemo, da obstaja linearna povezava med vrednostjo CT vsake predloge in logaritmom začetne številke kopije te predloge. Višje kot je začetno število kopij, manjša je vrednost CT in obratno. Z uporabo standardov z znanimi začetnimi kopijami je mogoče izdelati umeritveno krivuljo, kjer abscisa predstavlja logaritem začetne kopije, ordinata pa vrednost CT. Torej, dokler je pridobljena vrednost CT neznanega vzorca, je mogoče izračunati začetno število kopij vzorca iz standardne krivulje.
vedeti več
Obstaja več indikatorjev za presojo, ali je krivulja ojačanja dobra ali ne:
Odgovor: Prevojna točka krivulje je očitna, zlasti eksponentna faza vzorca nizko težke frakcije je očitna, splošna vzporednost krivulje ojačanja je zelo dobra, osnovna črta je ravna, ni pojava naraščanja in ojačanje krivulja vzorca nizke koncentracije eksponentne faze je zelo dobra. očitno.
B: Naklon eksponentne faze krivulje je neposredno sorazmeren z učinkovitostjo ojačanja, večji kot je naklon, večja je učinkovitost ojačanja.
C: Standardna osnovna linija je ravna ali se rahlo zmanjšuje, brez očitnega naraščajočega trenda.
D: Vzporednost pomnoževalnih krivulj za vsako epruveto je dobra, kar kaže, da je učinkovitost pomnoževanja vsake reakcijske epruvete podobna.
5. Krivulja taljenja
Ko se produkt PCR segreje, ko se temperatura dvigne, dvoverižni produkt pomnoževanja postopoma disociira, kar povzroči zmanjšanje intenzivnosti fluorescence. Ko je dosežena določena temperatura, se izloči velika količina produkta, kar povzroči močno zmanjšanje fluorescence. Uporaba te funkcije skupaj z različnimi vrednostmi TM za različne produkte PCR se razlikuje tudi v temperaturi, pri kateri se fluorescentni signal hitro zmanjša, kar je lahko dober način za identifikacijo specifičnosti PCR.
6. Talilna krivulja (z uporabo logaritemske krivulje)
Graf vrhov je oblikovan z logaritmom krivulje taljenja za bolj intuitiven prikaz položaja fragmentov izdelka. Ker je temperatura taljenja vrednost TM fragmenta DNA, je mogoče določiti nekatere parametre, ki vplivajo na vrednost TM fragmenta DNA, kot so velikost fragmenta, vsebnost GC itd. da je dolžina pomnoženega produkta v območju 80-300bp, temperatura taljenja pa mora biti med 80 in 90 stopinjami.
O: Če obstaja samo en glavni vrh med 80 in 90 stopinjami, to pomeni, da je PCR v realnem času popoln.
B: Če se glavni vrh pojavi med 80 stopinjami in 90 stopinjami, vrh nečistoč pa se pojavi pod 80 stopinjami, se v bistvu upošteva primer-dimer. To je dobra možnost, da poskusite rešiti z zvišanjem temperature žarjenja.
C: Če se glavni vrh pojavi med 80 stopinjami in 90 stopinjami in se tavajoči vrh pojavi, ko se temperatura poveča, se v bistvu upošteva kontaminacija DNK. In DNK je treba odstraniti v začetnih fazah poskusa.
7. Standardna krivulja
Standardne standarde smo razredčili na različne koncentracije in uporabili kot predloge za reakcije PCR. Standardna krivulja je narisana z logaritmom standardnega števila kopij na abscisi in izmerjeno vrednostjo CT kot ordinato. Pri kvantificiranju neznanega vzorca je mogoče število kopij vzorca pridobiti iz standardne krivulje na podlagi vrednosti CT neznanega vzorca. Standardne krivulje so zelo pomembne za absolutno kvantifikacijo.
drugi del. pogosta težava
V1: Kakšna je razlika med RT-PCR, QPCR, PCR v realnem času in RT-PCR v realnem času?
A1: RT-PCR je PCR z reverzno transkripcijo, ki je pogosto uporabljena različica verižne reakcije s polimerazo. Pri RT-PCR se veriga RNA reverzno prepiše v komplementarno DNA, ki se nato uporabi kot predloga za PCR za pomnoževanje DNA s PCR.
PCR v realnem času in QPCR sta ista stvar, oba sta kvantitativna PCR v realnem času, kar pomeni, da se v vsakem ciklu med postopkom PCR beležijo podatki v realnem času. Na ta način je mogoče natančno analizirati število zagonskih predlog.
Čeprav se zdi, da se PCR v realnem času in PCR z reverzno transkripcijo skrajšata kot RT-PCR, je mednarodna konvencija, da se RT-PCR nanaša posebej na PCR z reverzno transkripcijo, medtem ko se PCR v realnem času pogosto skrajša kot qPCR (Quantitative Real- True Real-True Real PCR ) - časovni PCR).
RT-PCR v realnem času (RT-QPCR) je vrsta PCR z reverzno transkripcijo, ki združuje fluorescentne kvantitativne tehnike: najprej reverzno prepisovanje iz RNA, da se pridobi cDNA (RT), ki ji sledi kvantitativna analiza z uporabo PCR v realnem času (QPCR).
V2: Zakaj je dolžina pomnoženega produkta fluorescenčnega kvantitativnega PCR nadzorovana v območju 80-300bp?
A2: Dolžina vsakega genskega zaporedja je drugačna, nekateri med njimi so več Kb in stotine BP. Vendar pa moramo pri oblikovanju primerja zahtevati le, da je dolžina produkta 80-300bp, prekratek ali predolg pa ni primeren za kvantitativno detekcijo PCR.
Fragmenti izdelka so prekratki, da bi jih razlikovali od primerjev-dimerjev. Dolžina primer-dimera je približno 30-40bp, ko je manjša od 80 bp, je težko ločiti, ali gre za primer-dimer ali produkt. Če je fragment produkta predolg in presega 300 bp, bo to zlahka povzročilo nizko učinkovitost pomnoževanja in količine gena ni mogoče učinkovito zaznati.
Na primer, ko štejete število ljudi v razredu, morate prešteti le, koliko ust je. Enako velja pri testiranju genov. Odkriti morate samo določeno zaporedje gena, da predstavljate celotno zaporedje. Zlahka se zmotiš, če šteješ usta in nosove, ušesa in očala, da šteješ ljudi.
V3: Kakšna je optimalna dolžina za temeljni premaz?
A3: Na splošno so primerne dolžine v območju 20-24bp dobre. Seveda pa moramo biti pri načrtovanju temeljnega premaza pozorni na vrednost TM temeljnega premaza, ker je ta povezana z optimalno temperaturo žarjenja. Po številnih poskusih je bilo dokazano, da je 60 stopinj dobra vrednost TM. Nizka temperatura žarjenja lahko zlahka povzroči nespecifično ojačanje, medtem ko visoka temperatura žarjenja običajno povzroči nizko učinkovitost ojačanja, pozen vrh krivulje ojačanja in zapoznelo vrednost CT.
Vprašanje 4: Ali količina zbranega vzorca vpliva na eksperimentalne rezultate?
O4: Ne. Očitno bo več vzorcev zbranih, več ekstrahirane RNA, več cDNA in več ciljnih fragmentov bo. Za absolutno kvantifikacijo je treba izračunati število kopij ciljnega fragmenta, količina zbranega vzorca pa bo zagotovo vplivala na eksperimentalne rezultate. Na primer, odkrivanje HBV virusa hepatitisa C v krvi je odkrivanje vsebnosti HBV v določeni količini (1 ml) krvi.
Za relativno kvantifikacijo, ki se običajno uporablja v znanstvenih raziskavah, število vzorcev nima nobene zveze z eksperimentalnimi rezultati, ker se relativna kvantifikacija nanaša na primerjavo med ciljnim in referenčnim genom. Prosimo, upoštevajte jih kot zgornje in spodnje fragmente, prisotne v isti verigi nukleinske kisline. Če je velikost vzorca velika, se referenčni in ciljni geni hkrati povečajo v enakem deležu, kar pa ne vpliva na rezultate.
V5: Ali bo učinkovitost reverzne transkriptaze vplivala na eksperimentalne rezultate?
A5: Enako kot zgoraj. Upoštevajte, da želimo večjo učinkovitost RT, vendar raje želimo, da je encim RT razmeroma stabilen in dobi enotne rezultate. To bo preizkus optimiziranih zmogljivosti paketov za obratno prepisovanje večjih podjetij.
Vprašanje 6: Ali učinkovitost encima TAQ vpliva na eksperimentalne rezultate?
A6: Učinkovitost encima TAQ je relativno velika. Običajno so potrebni encimi taq za vroč zagon in so relativno učinkoviti. Za komercialne komplete za kvantitativno fluorescenco bo vsak proizvajalec optimiziral učinkovitost najboljšega stanja glede na lastne izdelke blizu 100 odstotkov; če je učinkovitost prenizka, eksperimentalnih rezultatov ni mogoče dobiti. Za izdelke različnih podjetij je to merilo kakovosti.
Vprašanje 7: Ali količina fluorescenčnega barvila vpliva na eksperimentalne rezultate?
A7: Da, bo. Če je fluorokrom preveč nasičen, lahko povzroči hrupne motnje v nekaterih instrumentih. Če fluorokrom ni nasičen in je vrednost fluorescence prenizka, bo zgodaj vstopil v fazo platoja in krivulja pomnoževanja bo ravna. V kvantitativnem poskusu fluorescence se v glavnem vidi vrednost CT, zato ni pomembno, da krivulja pozne ojačanja preide v fazo platoja, vendar slika ni dovolj lepa. Če bi morali izbirati, začnite z izbiro fluorokroma, ki je nekoliko manj nasičen. Pri uporabi istega izdelka istega podjetja pa je njegov učinek načeloma zanemarljiv.
Vprašanje 8: Ali bo prenos epruvete PCR vplival na eksperimentalne rezultate?
A8: Da. Vendar pa je za isto serijo potrošnega materiala istega proizvajalca ta učinek mogoče zanemariti. To je dobra izbira in najbolje je uporabiti 96-ploščo z vdolbinicami z visoko prepustno membrano, da zmanjšate učinek prepustnosti svetlobe potrošnega materiala.
V9: Ali bodo napake med delovanjem vplivale na eksperimentalne rezultate?
A9: Vpliv postopka delovanja se odraža predvsem v enotnosti. Homogenost pomeni, da so vse komponente v sistemu enakomerno pomešane, ta problem pa lahko reši bliskovito centrifugiranje. Poleg tega je za začetnike najbolje prilagoditi sistem PCR na več kot 20 palcev, premajhen sistem pa je bolj nagnjen k napakam. Če je temperatura žarjenja pravilno optimizirana, je učinek koncentracije primerja na CT čim manjši. In vedeli boste, da se je nekaterim operativnim napakam (kot je koncentracija primerja) mogoče izogniti z optimizacijo temperature žarjenja.
Povzemite
Zgoraj je navedenih nekaj vprašanj in vprašanj, s katerimi se novinci med poskusom pogosto srečajo. Upamo, da vam bodo ta vprašanja pomagala rešiti nekaj zmede. Eksperimentiranje je proces ustvarjanja kaosa in reševanja problemov, upajmo, da boste iz tega kaj dobili. Hvala za branje in se vidimo naslednjič!