Danes se pogovorimo o ključnem elementu poskusov PCR – potrošnem materialu. Ker pogosto obiščete PCR, morate razumeti značilnosti in terminologijo v zvezi s potrošnim materialom za PCR.
Na trgu je veliko različnih potrošnih materialov za PCR, vključno z blagovnimi znamkami, specifikacijami, barvami itd., ki so bleščeči. Razumejmo korak za korakom.
pcr plošča
1. Materiali
Običajno je surovina potrošnega materiala za PCR polipropilen. Je dober toplotno odporen inertni material. Razpon delovne temperature je od -30 do 140 stopinj, kar mu omogoča, da prenese spremembe toplotne energije med termičnim ciklom reakcije PCR in ima dobro vlogo pri tesnjenju in zaščiti snovi v reakcijskem sistemu PCR.
Več o polipropilenu
2. Barva
Običajne so bele epruvete in prozorne epruvete za PCR. Pri tradicionalnih PCR poskusih ni razlike med obema. Vendar pa so bile v istem poskusu v realnem času/qPCR bele epruvete razmeroma bolj občutljive in dosledne za instrumente qPCR z odčitki apikalnih signalov (glejte sliki A in B spodaj). zakaj je tako
pcr cev
A: nižje vrednosti Ct za bele cevi v primerjavi s prozornimi cevmi; B: boljša ponovljivost z belimi cevmi.
Osnovni podatek qPCR je vrednost Ct, fluorescenčni signal pa je vir podatkov za izračun vrednosti Ct, zato je zelo pomembno, ali se lahko fluorescenca v cevi v celoti prenese na detektor. Bela stena cevi preprečuje, da bi fluorescenca prešla skozi steno cevi in se lomila (slika A spodaj), s čimer preprečuje, da bi se fluorescenca prenesla na grelni blok (tj. steno kovinske luknje, kjer je nameščena cev) in absorbirala ali nedosledno odraža blok. Močnejši in bolj koncentriran fluorescentni signal je bil zbran na konici bele cevi v primerjavi s prozorno cevjo (slika B spodaj).
pcr cev
O: Trend spreminjanja fluorescenčnega signala v prozorni in beli cevi; B: Primerjava intenzivnosti fluorescence po dodajanju enake količine fluoresceina.
Če torej uporabljate instrument qPCR z najvišjim odčitavanjem, poskusite z belimi epruvetami.
3. Kakovost (vitko ali nevitko)
Tukaj je poudarjen pomen kakovosti potrošnega materiala. Potrošni material za qPCR ne sme vsebovati kontaminantov in inhibitorjev. Visok pritisk in sevanje odstranita bakterije in DNaze, ne pa tudi prahu in ostankov DNK, ki lahko zavirajo reakcije PCR ali povzročijo nespecifično pomnoževanje. Snovi imajo absorbanco in celo majhna onesnaževala bodo absorbirala fluorescenco v reakcijskem sistemu in vplivala na zbiranje fluorescenčnih signalov. Za prikaz učinka onesnaženja z nečistočami na poskus je bila uporabljena pretirana različica poskusa. Kot je prikazano na spodnji sliki, je bila nečistota postavljena v eno od reakcijskih vdolbinic oktave. Kot je bilo pričakovano, so krivulje ojačanja pokazale izrazite anomalije.
Nečistoče v reakcijskih epruvetah PCR
↑ Nečistoče v reakcijski cevi
8 trakov
↑ Ponovljeni rezultati reakcije za 8 epruvet, nečistoča v levi vdolbinici "odstopa" od krivulje.
Opomnik: Pazite, da potrošnega materiala ne izpostavljate zraku dlje časa. Ko vzamete potrošni material, embalažno vrečko hitro zaprite, da se je ne dotaknete z golimi rokami. Če je mogoče, delajte na čisti klopi.
4. Zmogljivost / velikost / tok
Volumen določa, koliko vzorca (reakcijski volumen) lahko naložimo. Preveliko odmerjanje lahko povzroči zmanjšano učinkovitost prenosa toplote, razlitje ali navzkrižno kontaminacijo; premajhno odmerjanje lahko povzroči izgubo vzorca zaradi izhlapevanja. Grelni blok instrumenta qPCR bo tudi določil uporabne potrošne materiale in uporabno velikost reakcijskega sistema. Prepustnost je lahko razumljiva, to je največje število vzorcev, ki jih je mogoče naložiti v enem poskusu. Skupne specifikacije zmogljivosti in pretoka so prikazane v spodnji tabeli:
Ena cev/osem vrst {{0}}.2mL, 0,1mL
{{0}}plošča z vdolbinicami 0.2mL, 0,1mL
{{0}}plošča z vdolbinicami 0,2 ml
Tudi specifikacije zmogljivosti so na splošno razdeljene na standardne in nizke vrste, kot je prikazano spodaj. Potrošni material z nizkim profilom ima nižjo višino. Ta kratka zasnova zmanjša prostor nad reakcijskim sistemom (»mrtva prostornina« – neuporaben del), zmanjša učinke izhlapevanja med toplotnim kroženjem in omogoči, da se grelni modul v večji meri ovije okoli njega, da se izboljša učinkovitost prenosa toplote. Zato so nizkoprofilne cevi znane tudi kot "hitre" cevi ali plošče.
pcr cev
Opomnik: Običajno uporabljena reakcijska prostornina je 20 µL, priporočljivo pa je, da uporabite reakcijsko epruveto majhne prostornine 0,1 ml ali majhno prostornino.
5. Debelina stene
Debelina stene cevi neposredno vpliva na toplotno prevodnost. Potrošni material za PCR mora imeti enakomerno debelino stene, da zagotovi dosleden prenos toplote. Ultratanka cevna stena je za 50 odstotkov tanjša od standardne izvedbe, kar dodatno zmanjša toplotno bariero ter prinaša hitrejše in boljše odzivne učinke. Da bi povečali učinkovitost reakcij PCR in zagotovili stabilne in učinkovite reakcije, so uniformni in ultra-tanki potrošni materiali PCR najboljša izbira.
6. Preglednost
Pokrovčki in tesnilne folije za qPCR zahtevajo visoko optično čistost, da zagotovijo optimalno penetracijo in prenos fluorescenčnih signalov, hkrati pa zmanjšajo popačenje (za instrumente qPCR z odčitavanjem od zgoraj). Večja kot je prosojnost stene cevi, lahko vpliva na eksperimentalne rezultate. Razlog je bil razložen zgoraj. Tradicionalni PCR lahko zanemari to funkcijo.
7. Krila
Obroba plošče PCR se nanaša na periferni podaljšek plošče. Pri gradnji reakcijskih sistemov obloga deluje kot stabilna podpora za postopke pipetiranja in zagotavlja mehansko trdnost in oprijem v kombinaciji z avtomatiziranimi delovnimi postajami. Obstajajo tri običajne vrste kril, polkrila in polna krila (ki ustrezajo A, B in C na spodnji sliki).
Skirtless: Lahko se uporablja z večino instrumentov PCR ali qPCR, vendar ne za avtomatizirane aplikacije. Enostaven za premikanje med pipetiranjem, ni zelo stabilen, treba ga je uporabljati z držalom za ploščice.
Polovice: idealne za avtomatizirane aplikacije z dobro stabilnostjo pipetiranja.
Polna obroba: idealna za avtomatizirane aplikacije. Dobra mehanska trdnost, primeren za instrumente PCR s štrlečimi moduli, visoka stabilnost med pipetiranjem.
pcr plošča
Nasveti: Pomen krila je bolj olajšati industrializacijo in avtomatizirano serijsko obdelavo v kombinaciji z robotsko roko. Morda ne bo potrebno v tradicionalnih raziskovalnih laboratorijih, nobeno krilo ne zadostuje.
pcr plošča
8. Parafilm
Tesnilna folija PCR plošče je izdelana iz prozorne plastike ali aluminijaste folije. Lepilne prozorne folije so pogostejše, primerne za plošče s 96 ali 384 jamicami in morajo imeti dovolj dobro prepustnost svetlobe. Pri tesnjenju folije boste z majhno kartico pritisnili folijo okoli luknje za tesnjenje, da preprečite uhajanje zraka.
Lepilne aluminijaste folije so morda manj pogoste. Čeprav ni primeren za qPCR, je idealen potrošni material za vzorce, občutljive na svetlobo. Ker ga je mogoče luknjati, olajša prenos vzorca v PCR (za običajni PCR).
Tesnilni film za PCR ploščo
Povzemite
Kot nosilec sistema PCR je potrošni material zelo pomemben za izboljšanje kakovosti eksperimentalnih podatkov. Upam, da vam bo ta skupna raba pomagala razumeti nekaj nasvetov o potrošnem materialu za PCR in nuditi pomoč pri boljši izbiri potrošnega materiala.
