Kaj je celična kultura?
celične kulture
Celična kultura se nanaša na proces gojenja celic v nadzorovanih pogojih izven njihovega naravnega okolja. Je in vitro orodje, ki olajša razumevanje celične biologije in mehanizmov bolezni. Prav tako igra vlogo pri odkrivanju zdravil, kot so testiranje toksičnosti zdravil in farmakokinetične/farmakodinamične študije ter personalizirana medicina.
Ameriški embriolog Ross Granville Harrison je v začetku 20. stoletja razvil prve tehnike celične kulture in vitro, ko je in vitro uspešno vzgojil fragmente tkiva iz žabjih zarodkov. Danes je celična kultura pripomogla k neštetim odkritjem, kot je razvoj cepiv proti otroški paralizi, ošpicam, mumpsu in drugim nalezljivim boleznim.
Adhezijska in suspenzijska kultura
Obstajata dva osnovna sistema za rast celic: adherentna kultura in suspenzijska kultura. Adherentne kulture gojimo na umetnih substratih, medtem ko celice v suspenzijskih kulturah prosto plavajo v mediju. Medtem ko le nekaj tipov celic naravno raste v suspenziji (npr. limfociti), je mogoče številne tipe celic, ki se držijo, prilagoditi suspenzijski kulturi.
Obstajata dva razloga za gojenje naravno pritrjenih celic v suspenziji. Prva prednost suspenzijske kulture je lažji prehod celic, ker vam jih ni treba encimsko ali mehansko ločiti od posode s kulturo. Drugič, suspenzijske kulture je lažje povečati, ker je rast celic omejena le z njihovo koncentracijo v mediju, ne pa z razpoložljivo površino. Glavna pomanjkljivost suspenzijskih kultur je, da zahtevajo dnevno število celic in teste sposobnosti preživetja, da sledijo vzorcem rasti, medtem ko je adherentne kulture mogoče enostavno pregledati pod mikroskopom.
2D in 3D metode
Privržene kulture lahko nadalje razdelimo na 2D in 3D kulture. V 2D aplikacijah se adherentne celice gojijo v enoplastnem sistemu na ravni površini, na primer v bučki za celično kulturo.
celične kulture
Zaradi svoje preprostosti 2D tehnologija ne more posnemati in vivo okolja celic, ki običajno rastejo v tridimenzionalnih strukturah s kompleksnimi interakcijami med celicami. Zato se nekateri poskusi izvajajo z uporabo 3D kultur, ki jih je mogoče gojiti s tehnologijami na podlagi ali brez ogrodja.
3D metode, ki temeljijo na ogrodju, običajno vključujejo rast adherentnih celic v hidrogelnih ogrodjih. Za nekatere aplikacije se uporabljajo tudi alternative, kot so biokeramični, kovinski ali polimerni odri.
Tehnike brez odra se uporabljajo za gojenje sferoidov z eno od treh različnih metod:
Prisilno lebdenje: Celično suspenzijo naložite v vdolbinice mikroplošče, prevlečene s polimerom, z nizko oprijemljivostjo. Mikroploščo nato centrifugiramo, da se celice oblikujejo sferoidi.
Viseča kapljica: celično suspenzijo naložimo v vdolbinice viseče kapljice. Kot že ime pove, bo vzmetenje viselo na plošči kot kapljice. Celice se bodo združile na konicah teh kapljic in oblikovale krogle.
Na podlagi mešanja: celična suspenzija se postavi v rotacijski bioreaktor. Zaradi nenehnega mešanja se celice niso mogle prilepiti na stene in tako so nastale sferoidi.
Izziv celične kulture
Kljub razlikam v metodah in tehnikah imajo vsi poskusi eno skupno stvar: težko je gojiti žive celice v potrebnem številu za pridobitev ponovljivih rezultatov. Zato bodo naslednji razdelki namenjeni štirim izzivom – ponovljivosti, kontaminaciji, izvedljivosti in prehodu na avtomatizacijo.
ponovljivost
Po raziskavi Yongyue Medical je več kot 70 odstotkov znanstvenikov poročalo, da jim ni uspelo reproducirati eksperimentov drugega znanstvenika, več kot polovici pa ni uspelo reproducirati svojega dela. Pri testih celične kulture večina težav s ponovljivostjo izhaja iz bioloških razlik med celičnimi prehodi ali generacijami. Druga velika težava je napačna identifikacija celičnih linij, pomembno vlogo pa igrajo tudi nedoslednosti parametrov kulture.
biološka variacija
Dejavniki, kot so naključne mutacije ali napake pri prepisovanju, lahko vplivajo na ponovljivost poskusov vsakič, ko se celica deli. Da bi se temu izognili, morate na začetku novega projekta ustvariti celično banko.
celična banka
Celično bančništvo se nanaša na postopek shranjevanja serij določenih vrst celic za poznejšo uporabo, da se izognemo dejavnikom, kot so naključne mutacije ali napake pri prepisovanju, ki vplivajo na ponovljivost. Prvi korak je vzpostavitev glavne celične banke (MBC) z gojenjem izbranih vrst celic, ki so zanimive za kulturo, in njihovim kriokonzerviranjem v več posodah. Serije MBC se odmrznejo in kasneje uporabijo za pripravo delovnih celičnih bank (WBC).
Napačna identifikacija celičnih linij
Problem napačne identifikacije celičnih linij je znan že od šestdesetih let prejšnjega stoletja, ko je znanstvenik opisal kontaminacijo celic HeLa 19 drugih človeških celičnih linij. Če želite zagotoviti, da so vaši rezultati zanesljivi in, kar je še pomembneje, da ne delate napačnih zaključkov, morate vse nove celične linije, ki vstopajo v laboratorij, dati v karanteno, dokler ni preverjen njihov izvor. Najpomembneje je, da je priporočljivo ponoviti kvalifikacijo celične linije pred kriokonzervacijo in distribucijo v druge laboratorije ter po zaključku projekta. Če želite preveriti celično linijo, morate najprej preveriti, ali je navedena v registru napačno identificiranih celičnih linij. Če ni registriran, morate še vedno potrditi njegovo pristnost. Za človeške celične linije je priporočljiva analiza s kratkimi tandemskimi ponovitvami (STR) (prstni odtis DNA). Za nečloveške celične linije so na voljo različne metode testiranja, vključno s kariotipizacijo, izoencimsko analizo in tipizacijo mitohondrijske DNK (črtno kodiranje DNK).
Parametri kulture
Tretji dejavnik, ki vpliva na ponovljivost, so parametri kulture.
Na primer, ravni kisika lahko pomembno vplivajo na gojene celice. Vendar pa spremenljivke, ki vplivajo na oksigenacijo, kot je velikost komore ali gostota celic, niso vedno dokumentirane in jih zato ni mogoče ohraniti dosledne.
Drug pomemben parameter kulture je medij. To zagotavlja bistvena hranila, rastne faktorje in hormone ter uravnava pH in osmotski tlak. Zato je najbolj pomembno, da je njegova sestava vedno enaka. To je še posebej kritično za srednje velike formulacije, dopolnjene s fetalnim govejim serumom (FBS), katerih sestava je odvisna od dejavnikov, kot so prehrana krave, geografska lokacija in letni čas. Da zmanjšate učinek FBS na ponovljivost rezultatov, naročite različne serije seruma, ko trenutne zaloge začnejo zmanjkovati, in jih testirajte, da najdete najbližje ujemanje. Da bi drugi lahko ponovili vaše rezultate, morate poročati, kako ste pregledali serum, in zabeležiti številko serije.
celične kulture
Obdelava celic
Večina raziskovalcev ve, da imajo parametri kulture velik vpliv na njihove aplikacije, vendar so spremembe v tehnikah obdelave pogosto spregledane.
onesnaženje
Ko celice izoliramo iz tkiva in gojimo v laboratoriju, jih imunski sistem ne ščiti več in so zato izjemno ranljive za kontaminacijo.
Prvi vir kontaminacije so abiotski kontaminanti, kot so nečistoče v gojišču, serumu, dodatkih ali vodi, pa tudi endotoksini in izlužki. Previdnostni ukrepi vključujejo uporabo laboratorijske vode za poskuse s celičnimi kulturami ter medijev, seruma, dodatkov in potrošnega materiala proizvajalcev, ki ponujajo certifikate za testiranje endotoksinov. Poleg tega mora biti potrošni material izdelan iz čistega polistirena ali polipropilena, da zagotovite, da plastični dodatki ne prodrejo v vašo celično kulturo.
Drugi vir kontaminacije so biološki onesnaževalci, kot so bakterije (vključno z mikoplazmo), glive in kvasovke.
izvedljivost
Viabilnost celic je opredeljena kot delež živih celic v vzorcu. Poleg kontaminantov, ki smo jih pravkar videli, obstajajo različni drugi dejavniki, ki vplivajo na sposobnost preživetja celic. Okoljski pogoji – temperatura, pH, osmotski tlak, razpoložljivost hranil ter koncentracije O2 in CO2 – so zelo pomembni. Večino teh spremenljivk nadzira medij in so specifične za tip celice, kar na žalost pomeni, da ne moremo zagotoviti posebnih smernic.
Ker so celice zelo občutljive na pritisk, bodite pozorni ne le na okoljske razmere, temveč tudi na tehnike ravnanja s tekočino.
Zadnji dejavnik, ki vpliva na sposobnost preživetja celic, je staranje. Večina končnih celičnih linij preživi 20 do 60 delitev, preden umre, kar pomeni, da jih je mogoče ponovno uporabiti le med 15 in 45 generacijami. Nato je treba kriokonzervirani vzorec odmrzniti iz celične banke. Neprekinjene celične linije se lahko razmnožujejo neomejeno dolgo, a ker so nagnjene k genetskemu zanašanju, jih je treba redno menjavati.
Za merjenje sposobnosti preživetja celic je mogoče uporabiti detekcijske teste z uporabo kolorimetričnih, fluorometričnih in bioluminiscenčnih metod. Pogosto uporabljena kolorimetrična metoda je metoda MTT, ki temelji na redukciji rumenih tetrazolijevih soli v vijolične kristale formazana v živih celicah.
96-plošče z vodnjaki
avtomatizacija
Številne zgoraj opisane izzive je mogoče rešiti z avtomatizacijo delovnih tokov celične kulture. Na primer, ravnanje s celicami bo vedno dosledno, kar pozitivno vpliva na ponovljivost in sposobnost preživetja. Najpomembneje je, da avtomatizacija zmanjša tveganje kontaminacije uporabnika.
Kljub tem prednostim je lahko avtomatizacija celotnih delovnih tokov izziv zaradi proračunskih razlogov, pomanjkanja prostora za robote ali ker ni dovolj sredstev za avtomatizacijo in potrditev vsakega koraka hkrati. Ampak to se da rešiti!