1. Obnova celic
Ko so bile kriokonzervirane celice odstranjene iz tekočega dušika, so bile odtajane z nenehnim stresanjem v vodni kopeli pri 37 stopinjah. Odmrznjene celice prenesite v epruveto za centrifugo, dodajte predhodno segreto popolno gojišče DMEM pri 37 stopinjah (od tega je fetalni goveji serum približno 10 odstotkov), nežno enakomerno pihajte, centrifugirajte pri 500 g 2 minuti in zavrzite supernatant.
Dodajte popolni medij DMEM za izpiranje in zavrzite supernatant. Dodajte popolno gojišče DMEM, nežno premešajte s pipetiranjem, naredite celično suspenzijo, jo nacepite v petrijevko/bučko in gojite v celičnem inkubatorju, ki vsebuje 5 odstotkov CO2.
2. Prehajanje celic
Ko gostota celic doseže 80 % ~ 90 % (prezgodnji pridelek ni zadosten, prepozne celice so v slabem stanju, subkultura v razmerju 1:2 do 1:10 ali več, na splošno generiranje celic 1:3 do 1:5, to je iz inokulacije celic. V času ločevanja in ponovne kultivacije smo celoten medij odstranili in dvakrat sprali z 1X PBS.
Dodajte tripsin (opomba: količina raztopine za razgradnjo je najboljša, da pokrije celice, optimalna temperatura za razgradnjo pa je 37 stopinj. Opazujte celice pod mikroskopom: opazujte prebavljene celice pod invertnim mikroskopom, če je citoplazma umaknjena, celice niso več povezani skupaj. Rezine, kar pomeni, da so celice v tem času pravilno prebavljene), jih prebavite in postavite v celični inkubator za približno 2-3 minut.
Dodajte ustrezno količino popolnega medija DMEM, da zaustavite tripsinizacijo, prenesite v epruveto za centrifugo in centrifugirajte pri 500 g 2 minuti, zavrzite supernatant, dodajte popolni medij DMEM za pranje in zavrzite supernatant.
Dodajte popolno gojišče DMEM, premešajte z nežnim pipetiranjem, odpipetirajte 10 mikrolitrov za štetje in nato nadaljujte s kulturo v celičnem inkubatorju, ki vsebuje 5 odstotkov CO2 glede na zahtevano prostornino celic.
3. Krioprezervacija celic
Ko gostota celic doseže 80-90 odstotkov, odstranite celoten medij in 2-krat sperite z 1X PBS. Dodajte tripsin za prebavo in postavite v celični inkubator za približno 2-3 min. Dodajte popolni medij DMEM, da zaustavite razgradnjo tripsina, prenesite v epruveto za centrifugo in centrifugirajte pri 500 g 2 minuti, zavrzite supernatant, dodajte popolni medij DMEM za pranje in zavrzite supernatant. Dodajte 1 ml raztopine za zamrzovanje (90 odstotkov fetalnega govejega seruma, 10 odstotkov DMSO. Na splošno lahko vsebnost seruma prilagodite med 10 in 90 odstotki. Dodajanje seruma raztopini za zamrzovanje lahko zagotovi hranila za celice na eni strani in lahko Zagotovite neprepustne zaščitne snovi med kriokonzervacijo celic, kot so saharoza, albumin itd., da bolje zaščitite celice), dajte v epruveto za kriokonzervacijo (v epruveti je izopropilni alkohol, da zagotovite hitrost znižanja temperature), dajte takoj Zamrznite v hladilniku pri 4 stopinjah za 30 minut, nato ga postavite v hladilnik pri -20 stopinjah za 30 minut in nato čez noč postavite v hladilnik pri -80 stopinjah.
Naslednji dan ga damo v tekoči dušik, hranimo ga lahko najmanj dve leti, če ga ne damo v tekoči dušik, ga lahko hranimo tri mesece.
Načelo kriokonzervacije in obnavljanja celic je: počasno zamrzovanje in odmrzovanje, kar je bolj ugodno za ohranjanje sposobnosti preživetja celic. Krioprezervacija celic brez kakršnega koli zaščitnega sredstva bo povzročila proizvodnjo znotrajceličnih ledenih kristalov, ki bodo povzročili endogene mehanske poškodbe celic, povzročili spremembe v znotrajceličnem okolju, osmotski tlak, pH, elektrolite itd., in nato spodbudili celično smrt.
4. Zadeve, ki zahtevajo pozornost
(1) Predgretje raztopine kulture: pripravljeno stekleničko, ki vsebuje raztopino kulture, PBS in tripsin, postavite v vodno kopel pri 37 stopinjah, da se predhodno segreje;
(2) Uporabite 75-odstotni alkohol, da obrišete izjemno čisto delovno mizo in roke, ki so bile obsevane z ultravijoličnimi žarki;
(3) Pravilna namestitev uporabljenih instrumentov: zagotovite dovolj delovnega prostora, ki ni le enostaven za uporabo, ampak tudi zmanjša onesnaženje;
(4) Prižgite alkoholno svetilko: upoštevajte, da plamen ne sme biti premajhen;
(5) Strogo aseptično delovanje;
(6) Zmerna razgradnja adherentnih celic: na čas razgradnje vplivajo številni dejavniki, kot so vrsta raztopine za razgradnjo, čas priprave in količina, dodana v bučko s kulturo. Med procesom prebave je treba biti pozoren na spremembe v obliki gojenih celic. Ko se citoplazma skrči, če se povezava zrahlja ali se pojavijo znaki lebdenja v delcih, je treba prebavo takoj prekiniti;
(7) Vsi postopki na pasiranih celicah morajo biti čim bližje plamenu alkoholne svetilke. Najbolje je, da delate le z eno celico naenkrat, pri čemer za vsako celico uporabite en komplet opreme. preprečiti navzkrižno okužbo;
(8) Ustje steklenice pasirane celice je treba sterilizirati na alkoholni svetilki vsakič, ko se odpre ali zapre.
