Tehnologija PCR mora imeti umetno sintetizirane primerne primere in ekstrahirano vzorčno DNK, nato pa izvesti samodejno termično cikliranje in končno opraviti identifikacijo in analizo izdelka. Trenutno je zasnovo in sintezo temeljnih premazov mogoče izvesti le v nekaj raziskovalnih inštitutih, inštitutih in klinikah z močno tehnično močjo. Aplikacija mora za začetek dela kupiti samo komplet za odkrivanje PCR. V samodejnem termičnem ciklu PCR je veliko dejavnikov, ki vplivajo na to. Pri različnih vzorcih DNK so količina različnih komponent, dodanih v PCR reakciji, in parametri temperaturnega cikla neskladni.
Zdaj je predstavljenih več glavnih dejavnikov, ki vplivajo na to, kot sledi.
Prvi, parametri temperaturnega cikla
V avtomatskem termičnem ciklu PCR je najbolj kritičen dejavnik temperatura denaturacije in žarjenja. Kot je prikazano v primeru delovanja, so pogoji denaturacije, žarjenja in raztezanja: 94 ℃ 60 s, 37 ℃ 60 s, 72 ℃ 120 s, skupno 25 ~ 30 A cikel, ojačani fragment je 500 bp. Tu je treba izračunati čas vsakega koraka po tem, ko reakcijska zmes doseže zahtevano temperaturo. V avtomatskem termičnem ciklerju traja čas od prvotne temperature zmesi do zahtevane temperature 30-60s. Dolžina tega zamika je odvisna od več dejavnikov, vključno z vrsto reakcijske cevi, debelino stene, prostornino reakcijske zmesi, toploto vir (vodna kopel ali grelni blok) in temperaturno razliko med dvema korakoma, ki jo je treba ustrezno zagotoviti pri nastavitvi toplotnega cikla. Bodite pozorni in upoštevajte, dejansko meritev je treba izvesti na vsakem instrumentu.
Drug pomemben premislek o času termičnega cikla je razdalja med obema temeljnima premazoma; daljša kot je razdalja, dlje je potrebno za sintetizacijo celotne dolžine ciljnega zaporedja. Zgoraj navedeni reakcijski čas temelji na optimalni dolžini sinteze 500 bp. Ciljno zaporedje je sestavljeno. Tukaj je uvod v izbiro različnih temperatur.
1. Temperatura denaturacije predloge Temperatura denaturacije določa temperaturo, pri kateri se dvoverižna DNK stopi v reakciji PCR. Če temperatura denaturacije ni dosežena, ne bo nastala enoverižna DNK predloga in PCR se ne bo začel. Nizka temperatura denaturacije pomeni nepopolno denaturacijo, DNK dvoverižna. Hitro se bo renaturirala in tako zmanjšala donos. Na splošno 90～95 ℃. Ko vzorec doseže to temperaturo, ga je treba hitro ohladiti na temperaturo žarjenja. Denaturacija DNK traja le nekaj sekund in ni potrebna dolgo časa; nasprotno, pri visoki temperaturi bi morali po svojih najboljših močeh. Skrajšajte ga, da ohranite aktivnost Taq DNA polimeraze. Najvišja temperatura denaturacije po dodajanju Taq DNA polimeraze ne sme presegati 95 °C.
2. Temperatura žarjenja temeljnega premaza Temperatura žarjenja določa specifičnost in izkoristek PCR; če je temperatura visoka, je specifičnost močna, če pa je temperatura previsoka, se temeljni premaz ne more trdno združiti s predlogo in učinkovitost amplifikacije DNK se zmanjša; temperatura je nizka, donos je visok, vendar prenizek lahko povzroči neusklajenost temeljnega premaza in predloge , povečajo se nespecifični izdelki. Na splošno začnite z reakcijskim pogojem 37 ℃, nastavite vrsto kontrolnih reakcij, da določite optimalno temperaturo žarjenja za določeno reakcijo. Prav tako je mogoče sklepati na podlagi (G+}C) % vsebnosti temeljnih premazov, da bi razumeli test. Začetna točka splošnega preskusa, temperatura žarjenja Ta (temperatura žarjenja) je 5 ℃ nižja od temperature taljenja TTm (temperatura taljenja) ojačitvenega temeljnega premaza, ki se lahko izračuna po formuli:
Ta = Tm-5℃= 4(G{{2}}C){{4}} 2(A+T) -5℃
Med njimi A, T, G in C predstavljajo število ustreznih baz. Na primer, za temeljni premaz z 20 bazami, če je vsebnost (G+C)% 50%, lahko začetno točko Ta nastavite na 55°C. Pri tipični koncentraciji temeljnega premaza (kot je 0,2 μmol/L) se lahko reakcija žarjenja zaključi v nekaj sekundah in dolgotrajno žarjenje ni potrebno.
3. Izbira temperature razširitve primera je odvisna od optimalne temperature Taq DNA polimeraze. Na splošno 70～75 ℃, lahko standardna hitrost encimsko kataliziranih nukleotidov pri 72 ℃ doseže 35～100 nukleotidov/s. na minuto. Dolžino 1 kb je mogoče podaljšati, njena hitrost pa je odvisna od sestave puferske raztopine, pH vrednosti, koncentracije soli in narave DNK predloge. Če je pomnoženi fragment krajši od 150 bp, se lahko korak razširitve izpusti in postane dvojni temperaturni cikel zaradi Taq DNK. Polimeraza zadostuje za dokončanje sinteze kratkih sekvenc pri temperaturi žarjenja. Za fragmente kratkega zaporedja med 100 in 300 bp je učinkovita uporaba hitrega in preprostega cikla z dvojno temperaturo. V tem času je temperatura razširitve temeljnega premaza enaka temperaturi žarjenja. Za fragmente DNK nad 1 kb je mogoče čas podaljšanja nadzorovati v 1 do 7 minutah glede na dolžino fragmenta. Hkrati je treba v PCR pufr dodati želatino ali reagent BSA, da bo Taq DNA polimeraza dolgo časa aktivna in stabilna. Seks; 15%-20% glicerola pomaga povečati približno 2,5kb ali daljše fragmente DNK.
4. Število ciklov običajne PCR je na splošno 25 do 40 ciklov. Splošna napaka je, da je število ciklov preveliko, nespecifično ozadje je resno in kompleksnost narašča. Seveda je število ciklov reakcije premajhno, izkoristek pa nizek. Zato je treba zagotoviti, da je izdelek pridobljen. V skladu s predpostavko stopnje je treba število ciklov čim bolj zmanjšati.
Ko je amplifikacija končana, se vzorec ohladi in shrani pri 4°C.
2. Primer Primer Primer Design
Za pomnoževanje predlogne DNK morate najprej oblikovati dva oligonukleotidna primerja. Tako imenovani primerji sta pravzaprav dva oligonukleotidna fragmenta, ki sta komplementarna ciljnemu zaporedju DNK, ki ga je treba pomnožiti. Razdalja med obema primerjema določa dolžino pomnoženega fragmenta. , 5' konca dveh temeljnih premazov določata položaje dveh koncev 5' pomnoženega produkta. Vidi se, da so primerji ključni za določanje dolžine, položaja in rezultatov PCR amplificiranih fragmentov, bolj pomembna pa je zasnova primerja.
Potreben pogoj za načrtovanje primerja je, da mora biti znano zaporedje ciljne DNA, komplementarno primeru. Zaporedje med obema primeroma ni nujno jasno. Dve znani sekvenci sta na splošno 15-20 baz, ki jih je mogoče sintetizirati s sintetizatorjem DNK. Glede na dve komplementarni temeljni premazi, poleg tega načela, ki se na splošno upoštevajo pri oblikovanju temeljnih premazov, vključujejo:
1. Dolžina primera je izračunana v skladu s statistiko in verjetnost, da se v človeškem genomu pojavi oligonukleotidno zaporedje približno 17 baz, je enkrat. Zato dolžina osnovnega elementa na splošno ni manjša od 16 nukleotidov, najvišja pa ne več kot 30 nukleotidov, najboljša dolžina pa je 20-24 nukleotidov. Takšni kratki oligonukleotidi ne bodo tvorili stabilnega hibrida pri temperaturi polimerizacije (preko 72 °C). Včasih je lahko pri 5' Dodajte zaporedja, ki niso komplementarna predlogi na koncu, kot so mesta restrikcijskih encimov ali promotorji, da dokončate kloniranje genov in druge posebne potrebe; biotinska oznaka primera 5'end ali fluorescentna oznaka se lahko uporablja za različne namene, kot je odkrivanje mikrobov.
Včasih temeljni premaz' ne deluje, razlog ni znan, lahko premaknete položaj, da ga rešite.
2. Sestava temeljnih premazov z vsebnostjo (G+C) % mora biti enotna in poskušajte se izogniti vsebovanju istega osnovnega polimera. Vsebnost (G+C)% v obeh temeljnih elementih mora biti čim podobna, v znanem pomnoženem fragmentu (G+C) % Vsebina mora biti blizu fragmenta, ki ga je treba ojačati, na splošno 40% do 60% je bolje.
3. Notranjost temeljnega premaza se mora izogibati nastajanju očitnih sekundarnih struktur, zlasti struktur za lasnice. Na primer:
4. Med dvema temeljnima premazoma ne sme biti komplementacij, zlasti na 3' koncu temeljnega premaza. Tudi če se temu ni mogoče izogniti, 3'končna komplementarna baza ne sme biti večja od 2 bazi, sicer je enostavno tvoriti"primer dimer" Ali"Primer dimer" (Primer dimer). Tako imenovani primer dimer je v bistvu dvoverižni fragment DNA, ki nastane z razširitvijo enega primerja na drugo zaporedje primerja pod delovanjem DNA polimeraze. , Je pogost stranski produkt PCR in včasih celo postane glavni produkt.
Poleg tega se izogibajte homolognim zaporedjem med obema primerjema, zlasti oligonukleotidnih fragmentov z več kot 6 zaporednimi enakimi bazami, sicer bosta primera med seboj tekmovala za isto mesto predloge; podobno primeri in ciljna DNK, ki jo je treba pomnožiti. Ali druga zaporedja vzorčne DNK ne morejo imeti homolognih zaporedij več kot 6 baz. V nasprotnem primeru se bodo začetnice vežejo na druga mesta, kar zmanjša specifično ojačanje in poveča nespecifično ojačanje.
5. Primer 3'končna parna DNA polimeraza doda en nukleotid na 3'konec primera. Zato morajo biti zahteve za združevanje 5-6 baz s konca 3' primera in ciljne DNK natančne in stroge, da se zagotovi učinkovito ojačanje PCR. .
Ali je zasnova temeljnega premaza smiselna, je mogoče preveriti z računalniškim iskanjem s programsko opremo PCRDESN in programsko opremo American PRIMER.
Umetno sintetizirane oligonukleotide je treba prednostno očistiti s kromatografijo (kromatografijo) ali PAGE, da odstranimo nečistoče, kot so kratke verige, ki niso bile sintetizirane v polni dolžini. Prečiščeni temeljni premazi, shranjeni v 25 % raztopini acetonitrila pri 4 °C, lahko preprečijo nastanek mikroorganizmov. V normalnih okoliščinah je treba neuporabljene temeljne premaze shranjevati v hladilniku pri -20 °C. Primerje lahko v tekočini shranjujemo 6 mesecev, po liofilizaciji pa 1 do 2 leti.
