1. Okrevanje
●1. Kriovialo vzemite iz tekočega dušika, jo takoj postavite v vodno kopel pri 37 stopinjah in rahlo pretresite. Ko se tekočina stopi (približno 1-1,5 minut), jo vzemite ven, poškropite z alkoholom in jo položite na izjemno čisto delovno mizo.
●2. Zgornjo celično suspenzijo aspirirajte v 15 ml centrifugalno epruveto, napolnjeno z 10 ml medija (epruveto za kriokonzervacijo sperite z medijem, da izperete vse celice, ki so se oprijele stene), in centrifugirajte 5 minut pri 1000 obratih na minuto.
●3. Odlijte supernatant in dodajte 1 ml medija za suspendiranje celic. Aspiriramo v 10 cm petrijevko, ki vsebuje 10 ml gojišča, in jo nežno stresamo naprej in nazaj, da se celice v petrijevki enakomerno porazdelijo.
●4. Označite vrsto celice in datum, ime kultivatorja itd. in jo postavite v CO2 inkubator za gojenje. Ko se celice prilepijo na steno, zamenjajte gojišče.
●5. Zamenjajte medij vsake 3 dni.
2. Prehajanje
●1. Pasaža, ko pokritost celic v posodi s kulturo doseže 80 odstotkov -90 odstotkov.
●2. Aspirirajte izvirni medij.
●3. Dodajte ustrezen tripsin (ravno toliko, da pokrijete celice) in prebavite 1-2 minut.
●4. Ko so celice zaokrožene, dodajte enako količino medija, ki vsebuje serum, da zaključite prebavo.
●5. S pipeto suspendirajte celice s pipetiranjem.
●6. Celice aspirirajte v 15 ml centrifugalno epruveto in centrifugirajte 5 minut pri 1000 obratih na minuto.
●7. Odlijte supernatant, dodajte 1-2 ml medija in napihnite celice.
●8. Celice prenesite v več posod, odvisno od vrste celice. Na splošno obstaja 5 rakavih celic in 3 normalne celice. Nadaljujte s kultivacijo.
3. Kriokonzervacija Prebavite celice in centrifugirajte (ibid.). Celice suspendirajte s pripravljeno zamrzovalno raztopino in jih porazdelite v sterilizirane krioviale, pustite stati nekaj minut ter označite vrsto celice in datum kriokonzervacije. 4 stopinje za 30 minut, -20 stopinje za 30 minut, -80 stopinje čez noč, nato pa za shranjevanje v tekoči dušik. Priprava raztopine za kriokonzervacijo: 70 odstotkov popolnega medija plus 20 odstotkov FBS plus 10 odstotkov DMSO. DMSO je treba počasi dodajati po kapljicah in med kapljanjem stresati.
