1. V ploščo s kulturo trikrat po 3 minute namočite predmetna stekelca, ki ste jih preplezali s PBS.
2. Predmetna stekelca fiksirajte s 4-odstotnim paraformaldehidom za 15 minut in jih namočite v PBS 3-krat, vsakokrat po 3 minute.
3. Permeabilizirajte s 0.5 odstotki Triton X-100 (pripravljen v PBS) 20 minut pri sobni temperaturi (za antigene, izražene na celični membrani, ta korak izpustimo).
4. Blokiranje seruma: predmetna stekelca 3-krat po 3 minute potopite v PBS, posušite PBS z vpojnim papirjem, dodajte običajni kozji serum (pod pogojem, da je sekundarni vir protiteles koza) na predmetna stekelca in blokirajte pri sobni temperaturi za 30 min.
5. Dodajte primarno protitelo: absorbirajte blokirno raztopino z vpojnim papirjem, ne umivajte, dodajte zadostno količino razredčenega primarnega protitelesa na vsako stekelce in ga postavite v mokro škatlo, inkubirajte pri 4 stopinjah čez noč.
6. Dodajte fluorescenčno sekundarno protitelo: potopite stekelca v PBST 3-krat, vsakokrat za 3 minute, vsrkajte odvečno tekočino na stekelca z vpojnim papirjem, dodajte razredčeno fluorescenčno sekundarno protitelo po kapljicah, inkubirajte pri 20-37 stopinjah 1 uro v mokri škatli namočite v PBST Slice 3-krat, vsakokrat 3 minute.
Opomba: od dodajanja fluorescentnega sekundarnega protitelesa je treba vse nadaljnje korake izvajati čim bolj v temnem prostoru.
7. Blokiranje seruma: popivnajte tekočino z vpojnim papirjem, spustite običajni kozji serum na predmetno stekelce (pod pogojem, da je sekundarni vir protiteles koza) in blokirajte pri sobni temperaturi 30 minut.
8. Dodajte primarno protitelo: absorbirajte blokirno raztopino z vpojnim papirjem, ne umivajte se, nato dodajte razredčeno primarno protitelo po kapljicah in inkubirajte čez noč v vlažni škatli pri 4 stopinjah v temi po dodajanju primarnega protitelesa. (Opomba: vrsta drugega primarnega protitelesa se razlikuje od vrste prvega primarnega protitelesa, kot sta miš in zajec)
9. Dodajte fluorescenčno sekundarno protitelo: stekelca 3-krat potopite v PBST, vsakokrat za 3 minute, z vpojnim papirjem absorbirajte odvečno tekočino na stekelcih, po kapljicah dodajte razredčeno fluorescenčno sekundarno protitelo, inkubirajte 1 uro pri 20-37 stopinji v mokri škatli namočite v PBST Slice 3-krat, vsakokrat 3 minute. (Opomba: Če je za detekcijo prvega protitelesa izbrana rdeča fluorescenca, mora drugo izbrati druge barve fluorescence)
10. Protibarvanje jeder: DAPI je bil dodan po kapljicah in inkubiran v temi 5 minut, vzorci so bili obarvani in presežek DAPI je bil spran s PBST 5 min × 4-krat.
11. Posušite tekočino na stekelcu z vpojnim papirjem, zaprite stekelec z namestitveno tekočino, ki vsebuje dušilec proti fluorescenci, ter opazujte in zbirajte slike pod fluorescenčnim mikroskopom.
