V času po epidemiji nam je izraz »testiranje nukleinske kisline« znan vsem in je postal del našega vsakdana.
Torej, ali veste, kako testiranje nukleinske kisline odkrije viruse? In kako testiranje nukleinske kisline naredi nevidne viruse "vidne"?
01 Kaj je nukleinska kislina
Nukleinska kislina je splošni izraz za DNK in RNK.
Nukleinska kislina je bistvena sestavina vsega znanega življenja na zemlji. DNK, ki jo pogosto imenujemo deoksiribonukleinska kislina. Genetski material novega koronavirusa je RNA – ribonukleinska kislina.
Testiranje pomnoževanja nukleinske kisline
02 Kaj točno odkrije testiranje nukleinske kisline?
Snov za odkrivanje nukleinske kisline je nukleinska kislina virusa.
Novi koronavirus je virus, ki vsebuje samo RNK, specifično zaporedje RNK v virusu pa je marker, ki razlikuje virus od drugih patogenov. Namen detekcije nukleinske kisline je ugotoviti, ali je v pacientovem respiratornem vzorcu ali krvi nukleinska kislina tujega virusa, da se ugotovi, ali je okužen z novim koronavirusom. Velika večina trenutnega odkrivanja nukleinske kisline novega koronavirusa uporablja fluorescentno kvantitativno metodo PCR za pomnoževanje ciljnega zaporedja virusne RNA s PCR po reverzni transkripciji.
PCR ali verižna reakcija s polimerazo je tehnika molekularne biologije, ki se uporablja za pomnoževanje specifičnih fragmentov DNA; nanaša se na z DNA polimerazo katalizirano reakcijo specifičnih genov ali Reakcijo hitrega in vitro pomnoževanja zaporedij DNA imenujemo tudi gensko in vitro pomnoževanje. Tehnologija fluorescentne kvantitativne PCR je dodajanje fluorescenčnega reporterskega sistema reakcijskemu sistemu PCR in uporaba spremembe fluorescenčnega signala za spremljanje procesa PCR v realnem času, da se izvede kvantitativno zaznavanje začetne predloge.
Za odkrivanje nukleinske kisline je prvi korak odvzem vzorca. Trenutno je najbolj običajna metoda vzorčenja: uporaba brisov žrela ali nosu za brisanje in zbiranje zgornjih dihalnih poti (žrela ali nosne votline); zbrane vzorce bomo strogo zapečatili in nato poslali v laboratorij na postopno testiranje.
1. Ekstrakcija virusne RNA
Iz vzorca se najprej ekstrahira RNA virusa. Vzorcu dodajte reagente za ekstrakcijo nukleinske kisline, da uničite virus in sprostite nukleinsko kislino.
2. "Reverzna transkripcija" virusne RNA v cDNA
S tehnologijo reverzne transkripcije (RT) se RNA virusa "obrne" v specifično DNA, ki jo je bolj priročno zaznati, to je cDNA.
3. Pomnoževanje in detekcija cDNA
Ne glede na to, ali gre za bris žrela, nosu ali celo vzorčenje krvi, je vsebnost virusa v vzorcu relativno nizka, tudi pri hudo okuženih bolnikih (virusno breme je veliko); ker so virusni delci premajhni in je volumen vzorčenja omejen, je število virusov v vzorcu še vedno premajhno za detekcijo nukleinske kisline.
Zato inšpektorji s tehnologijo PCR ojačajo unikatno »geslo« novega koronavirusa v vzorcu do te mere, da ga oprema zazna, da presodijo, ali gre za pozitivno okužbo. Celoten proces grabljenja genskega materiala virusa je kot ribolov. Trnek ga bo prepoznal in zgrabil, tako da se virus nima kam skriti.
Preprosto povedano, gre za pomnoževanje števila cDNA, tako da se cDNA nenehno podvaja, tako da se število eksponentno poveča.
Standardni postopek PCR je razdeljen na tri korake:
Denaturacija: uporaba visoke temperature za ločevanje dvojnih verig DNK. Vodikove vezi med dvojnimi verigami DNK se prekinejo pri visoki temperaturi (93 - 98 stopinj).
Žarjenje: Ko se dvojne verige DNK ločijo, se temperatura zniža, da se primerji lahko vežejo na enoverižno DNK.
Podaljšanje: DNK polimeraza sintetizira komplementarno verigo vzdolž DNK verige iz vezanega primerja, ko se temperatura zniža. Ko je elongacija končana, je en cikel zaključen in število fragmentov DNK se podvoji. Ponovite te tri korake 25-35-krat in število fragmentov DNK se bo eksponentno povečalo.
PCR dvoverižna šablona
Medtem ko se cDNA pomnoži, fluorescenčne sonde v kompletu delujejo sočasno. Sprostil bo fluorescenčni signal in vsakič, ko se cDNA pomnoži, se bo fluorescenčni signal nekoliko povečal, detektor PCR pa lahko zabeleži vrednost Ct povečanja fluorescenčnega signala.
Vrednost Ct je pomemben pokazatelj za presojo, ali je nukleinska kislina virusa negativna ali pozitivna. Manj kot je začetna DNK, več ciklov PCR je potrebnih za dosego določenega praga in višja je vrednost Ct. Nasprotno, več ko je začetne DNK, nižja je vrednost Ct. Začetna količina DNA odraža količino virusne RNA v vzorcu, ta pa odraža količino virusa v vzorcu. Torej, če vrednost Ct ni zaznana ali je višja od določene vrednosti, se sumljivi bolnik oceni kot negativen; če je nižja od te vrednosti, je sumljivi bolnik ocenjen kot pozitiven.
Med PCR reakcijo je tudi izbira PCR potrošnega materiala eden najpomembnejših dejavnikov, ki vpliva na rezultate detekcije nukleinske kisline.
